【产品名称】
        通用名称：ALK 基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）
        英文名称：ALK Break Apart FISH Probe Kit 

【包装规格】      
      10 人份/盒、20 人份/盒
     
【预期用途】
      本产品用于定性检测福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）人非小细胞肺癌(NSCLC)组织 样本中间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排情况。以辅助诊断患者是否适合接受克唑替尼等 靶向药物的治疗。 本检测必须经医生批准方可检测使用，用以帮助判断患者是否适合接受非小细胞肺癌 (NSCLC)的相关药物治疗1,4。 

【检验原理】
      原位杂交法（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）能够使细胞制备过程中特定的核 苷酸序列清楚的呈现出来。而且，FISH 试验过程中包含了单链 DNA 精确的退火温度，荧光 标记的 DNA 探针能够与目标序列结合发出荧光，杂交之后的 DNA 片段能够直接在荧光显微 镜下观察到。经过福尔马林固定、石蜡包埋的组织放到玻片上面，DNA 首先经过变性成为单 链 DNA，随后与探针 DNA 有序结合。结合完成之后，多余的探针 DNA 被洗涤液清洗掉， 同时，细胞核被特定的 DNA 染色剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色荧光。杂交之后的 ALK 探针可以在荧光显微镜下观察到。
      当杂交的 ALK 基因重组探针生成之后，在自然状态下可以观察到 2p23 ALK 基因区域 会成为融合的红色和绿色信号。反之，若 2p23 ALK 区域发生断裂：红色和绿色信号分开且 距离大于两个信号直径的大小、或者是一个单独的红色信号显示为模糊或者分裂的单独信号 2-6。
      本试剂盒包含两组 ALK 探针 (红色/绿色）及 FISH 操作配套试剂。

【主要组成成分】
     

试剂	规格		主要成分
	10人份	20人份
ALK 探针	100μl	200μl	荧光标记探针、甲酰胺、SSC、硫酸 葡聚糖 胃
胃蛋白酶 IV	0.5g	0.5g	胃蛋白酶干粉
20×SSC	66g	66g	NaCl, C6H5Na3O72·H2O
NP-40	2ml	2ml	壬基酚聚氧乙烯醚
DAPI	0.5ml	0.5ml	DAPI/抗褪色液、甘油

      试剂盒未提供的常规试剂： 1mol/L 的盐酸，二甲苯、封片胶、无水乙醇。
      说明：不同批号试剂盒中各组分可以互换。

【储存条件及有效期】
      ALK 基因扩增检测试剂盒于-30℃至-15℃密封避光储存；
      自生产之日起有效期为一年。 

【适用仪器】
      本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交，如 ThermoBrite 等。
      本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果。所需荧光显微镜的配置包括：
      激发光源：激发光源建议使用 100w 汞灯，其寿命最长为 200 小时左右。建议记录下 该灯泡已使用的小时数，并在超过额定时间前更换。确保汞灯的正常状态。
      物镜：在使用含 100w 汞灯的显微镜时，应使用孔径为≥0.75 的油浸式荧光物镜。40× 物镜与 10×物镜一起联用时适用于扫描。在 FISH 分析上，使用 100×消色差浸油类型物镜可 取得满意效果。
      镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在荧光显微镜上 使用。
      滤光片：建议顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便 选择与标记荧光染料相适应的滤片组。
      绿色荧光：激发波长为 496nm，发射波长为 520nm，与 FITC 类似
      橘红色荧光：激发波长为 551nm，发射波长为 572nm，与 Rhodamine 类似 

【样本要求】 
适用样本：
      福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌组织和细胞。样本应根据实验室标准程序进行采集，试剂盒检验样本的选择应由病理学专业人员执行。样本应避免与酸、强碱接触，并 避免过热。
      选择的检验样本一般应在制备之后 6 周内进行 FISH 实验，否则可能会影响实验效果。
      建议切片厚度不超过 5μm。
拒收样本：
      1、登记表信息记录不完整的样本
      2、各机构主要研究者所认定的任何其他原因

【检验方法】
一、试剂配制：
1、乙醇溶液（70%乙醇、85%乙醇）   
      将700ml、850ml 无水乙醇用去离子水分别稀释至1L，使用期间2-8℃储存。试剂配制1个 月后或用于20张玻片杂交后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 2、20×SSC, pH7.0

组份	含量
20×SSC	66g
去离子水	200ml

      充分溶解，室温下用1M的HCl调节pH值至7.0, 用去离子水定容至500ml，高压灭菌，于2-8℃储存。若试剂出现混浊或污染应丢弃。
3、2×SSC，pH7.0±0.2

组份	含量
20×SSC	100ml
去离子水	800ml

     


      充分混匀，室温下用1M的HCl调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L，于2-8℃储存。 若试剂出现混浊或污染应丢弃。
4、0.3%NP-40/2×SSC洗液，pH7.5     

组份	含量
20×SSC	40ml
NP-40	1.2ml
去离子水	300ml

充分混匀，室温下用1M的NaOH调节pH值至7.5，用去离子水定容至400ml，于2-8℃储存。 若试剂出现混浊或污染应丢弃。
5、0.1%NP-40/2×SSC洗液，pH7.0±0.2   

组份	含量
20×SSC	40ml
NP-40	0.4ml
去离子水	300ml

      充分混匀，室温下用1M的NaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至400ml，于2-8℃储 存。若试剂出现混浊或污染应丢弃。
6、1M HCl

组份	含量
浓HCl	8.62ml
去离子水	80ml

      用去离子水定容至100ml，室温储存。若试剂出现混浊或污染应丢弃。

7、10mM HCl

组份	含量
1M HCl	1ml
去离子水	9ml

      充分混匀，室温储存。若试剂出现混浊或污染应丢弃。
8、胃蛋白酶

组份	含量
胃蛋白酶干粉	1g
10mM HCl	8ml

      充分溶解，用10mM HCl定容至10ml，分装，-20℃储存。
注意事项：
      为得到好的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。
      用于实验的2×SSC、0.3%NP-40/2×SSC洗液与0.1%NP-40/2×SSC洗液不可反复使用。

二、样本收集及玻片制备：
1、样本于常温下在10%中性福尔马林缓冲液中固定6~48小时，为了达到最佳的和均匀的固定 与石蜡包埋效果，样本大小不宜超过0.5cm3。
2、标准操作和石蜡包埋，使用高质量的石蜡。渗透和包埋应在低于65℃下进行。
3、切成4μm 厚度的切片。
4、切片捞于有氢化硅涂层玻片或黏性玻片并在50~60℃环境中固定2~16 小时。
注：可用以下方法处理载玻片：将载玻片浸入2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中5分钟， 随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片。

三、玻片预处理程序：
1. 56-65℃左右烤片过夜（至少 3 小时以上） 。
2. 提前预热胃蛋白酶处理液（2mg/ml，10mM HCl），使其温度达到 37℃保温备用。
3. 二甲苯中室温孵化切片 10 分钟，重复该步骤两次。
4. 100%乙醇中室温孵化切片 5 分钟，重复该步骤一次。
5.依次 85%、70%乙醇中室温孵化切片 3 分钟。
6.去离子水洗 2 分钟，3 次。
7.用微波炉将适量的去离子水煮沸后，然后使其处于保温状态，放入切片修复 20mins。
8.将切片直接放入蛋白酶消化液中，消化 15±10mins。 注：根据不同的多种因素，如片子固定的条件与过程，片子厚度，组织/细胞的特性，消化时 间可以不同，我们建议：对于组织切片样本消化 5-25 分钟，对于细胞样本消化 3-8 分钟。 一般来讲，我们建议预实验找到样本的最佳消化时间。且每次消化不超过 4 张切片。 9. 去离子水清洗 2mins，两次。
10. 脱水：70%，85%，100%乙醇溶液中依次孵育各 2 分钟，空气干燥切片。 

四．FISH操作步骤
警告和预防 
      荧光基团遇强光会产生光漂白现象。将含有荧光基团的试剂与玻片置于暗处有助于减少 此效应。所有不需光照的步骤（例如：孵育、洗涤等）均在暗处进行。
      FISH 实验操作过程中请注意防护，试剂勿与皮肤直接接触。
（一）标本变性与杂交
1. 将含有的ALK探针的杂交液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器吸10μl至各个样本。均匀滴 加探针到整个目标区域；或者加探针到盖玻片中央，再将目标区域反扣到盖玻片上。
2. 样本盖上盖玻片(20 mm× 20 mm)，避免气泡；封片胶封片。
3. 将玻片放入杂交仪中反应，83℃（±2 ℃）变性 6 分钟，40℃过夜杂交。
注意：杂交期间片子绝对不能干！
（二）杂交后的处理
1、小心除去封片胶。
2、将切片置于2×SSC溶液中，孵育10min，除去盖玻片。
3、将切片置于0.3%NP-40/2×SSC洗液（提前30min水浴加热到73±1℃）中，上下提拉切片1-3s， 孵育2mins。
4、室温条件下，将切片置于0.1%NP-40/2×SSC洗液中，上下提拉1-3s，孵育切片3mins。
5、在70%、85%的乙醇溶液中依次孵育切片2mins。
6. 避光晾干样本。
注：洗液缸中每次最好同时孵育4张切片，当最后一张玻片放入考普林缸时开始计时。
（三）观察
1. 滴加10 μl DAPI复染液到切片组织上，避免气泡，盖上盖玻片，用指甲油涂抹盖玻片边缘，2 / 3 暗处-20℃孵育30 分钟。
2. 于暗处保存切片。长期保存应放于-20℃。
3. 荧光显微镜下计数。 （四）储存 完成杂交的玻片置于-20℃避光储存。 
【结果阳性判断及参考区间】
结果分析注意事项：
1、样本需随机计数细胞。
2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。
3、杂交不均匀的区域不要分析。
4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。
5、背景深影响信号判断的区域不要分析。
6、计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定。
7、在分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位（需由病理科医师认定）。
8、如果超过 25％的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。
9、如果超过 10％的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。
10、首先判定玻片杂交的充分性   
      核形态：肿瘤细胞核的边界通常是清晰的，并且细胞核呈完整的形态；   
      背景状态：背景不应该含有影响计数的颗粒物质存在；   
      荧光信号强度：信号应该是亮的、明显的和易计算的。信号应该存在于亮光、椭圆形的。 避免过分分散的信号。   
      此外，目标区域必须包含至少 50 个测定细胞；
11、定位目标观测区域   
      使用低倍物镜 DAPI 滤光片观察杂交区域；   
      坏死组织和细胞核的边界容易模糊，观察时应避免此区域，同时应该避开细胞核染色不 足的区域；
12、目标区域的荧光信号观察   
      使用40×或100×的物镜和适合的滤光片观察ALK信号。调节聚焦观察目标信号和噪音（非 目标杂交信号）的大小和形状。确保背景不具有强烈的荧光干扰信号。   
      扫描整个组织区域，观察肿瘤细胞的整体荧光信号分布状态，选择较具代表性的区域进 行计数。
13、在目标区域内选择细胞并计数   
      选择细胞核分布较好的区域（如能区分单个细胞核的区域），并保证所选的区域能够代表 观察到的信号分布特征；开始分析细胞并记录每个细胞的荧光信号特征；重复上述操作，直 到技计数满 50 个细胞为止；
14、信号计数规则
14.1 调节聚焦数深度，找到细胞核中的信号所在部位。根据图 1 中的计数指南，对所选择的 具有明显界限的肿瘤间期细胞进行计数。
14.2 以下情况细胞为阴性（ALK 基因非重排）：   
      橙色和绿色信号相邻或融合（在橙/绿双通滤光片下观察为黄色）。橙色和绿色信号分离， 但是距离小于或等于两个信号直径的大小，这种情况也视为融合信号（图 2，第一组）。   
      单独存在一个绿色荧光信号，不伴有相应的橙色信号（图 2，第一组）
14.3 以下情况细胞为阳性（ALK 基因重排）：   
      至少有一组橙色和绿色荧光信号分离的距离超出两个信号直径大小（图 2，第 2 组）。   
      除了融合和/或分离的信号之外，单独存在一个橙色荧光信号，不伴有相应的绿色荧光信 号（图 2，第 2 组）


【检测结果的解释】
1、如果一个样本的记录结果为 50 个细胞中有 5 个以下为阴性，那么这个样本为阳性的；
2、如果一个样本的记录结果为 50 个细胞中有 25 个以上为阳性，那么这个样本为阳性的；                
3、如果 50 个细胞中有 5-25 个为阳性，那么这个样本为具有争议的，需请另外一个判读者对 此玻片重新读数。
      将两位判读者的结果加在一起，计算 100 个细胞中的阳性百分比（阳性细胞的平均百分 比）。
      阳性细胞的平均百分比小于 15%，那么这个样本为阴性。
      阳性细胞的平均百分比为大于等于 15%，那么这个样本为阳性的。
4、无效结果
如果一个样本的玻片在质量检查步骤时不符合评价玻片杂交充分程度的要求，那么这个样本 则为无效的。
5、杂交充分程度
如果一个样本的目标区域内所能观察并计数的细胞个数少于 50 个，那么这个样本是无效的。 
【检测方法的局限性】
      本试剂盒采用荧光原位杂交技术用于非小细胞肺癌ALK基因重排检测，不能用于其他 基因突变方式的检测。 
【产品性能指标】
1 细胞中期染色体探针定位
      ALK 探针杂交的位置经过培养的淋巴细胞滴片与 DAPI 复染技术。
      ALK 橙色和 ALK 绿色荧光探针，ALK 双色分离探针显示为与 2p23 染色体延伸区域， 在所有 8 个中期分裂相，而且不会与其他位置杂交。   
2 灵敏度和特异性
      分析灵敏度定义为具有预期正常信号模式的染色体目标百分比。分析特异性定义为结合 到正确位置的信号百分比。
      分析 ALK 橙色和 ALK 绿色荧光探针的特异性和分析灵敏度通过间期染色体进行评价， 从 5 个正常捐献者的外周血细胞培养物，共 6 分标本（6 个载玻片）。
      对于灵敏度评估，ALK 橙色和 ALK 绿色荧光探针的信号，计数每个间期分裂相的染色 体（正常为 2 个信号），每张片子计数 20 个中期细胞，每种探针的预期信号值为 240（参见 表 1）。 对于特异性评估，具有预期荧光信号的中期分裂相数目总共 120，（ 参见表 2）。

【注意事项】
1、供体外检测使用。
2、本试剂盒实验操作过程中，需戴乳胶手套操作，避免试剂接触肌肤。如不慎接触，立即 用大量水冲洗。
3、实验过程中的废弃样本及实验废弃物，需作为医疗废物统一回收处理
4、为得到理想的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。
5、实验过程中的常见问题及处理方法(见下表)：